摘要：用乙醇從亮菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中提取亮菌多糖，采用活性炭吸附色素，乙酸乙酯脫脂，sevage 法除蛋白，反復(fù)醇沉等工藝對亮菌多糖進(jìn)行純化。使用纖維素柱層析法和紙層析法對純化后的多糖進(jìn)行純度檢驗(yàn)，結(jié)合紅外光譜掃描和測定硫酸基含量兩種方法對得到的亮菌多糖進(jìn)行了簡單結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明：提取純化后的亮菌多糖基本沒有單糖和寡糖的存在，含量已達(dá)到 75%以上，純度較高，具有羥基、羰基、羥酸基、硫酸酯鍵等結(jié)構(gòu)，且硫酸基的含量為 98.32μg/g。
亮菌（Armillariella tabescens）屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目口蘑科，假蜜環(huán)菌屬，是一種能發(fā)光的擔(dān)子菌。亮菌是一種兼有食用和藥用價(jià)值的名貴食用菌，其主要活性成分為亮菌多糖。多糖是生物體內(nèi)普遍存在的一大類生物大分子，除有營養(yǎng)作用之外，還具有的生物活性和藥理特性。亮菌多糖作為一種低毒而免疫活性強(qiáng)、毒副作用少，來源廣的生物大分子，日益受到人們的注意和重視。亮菌多糖是一種性大分子化合物，常用水提醇沉的模式進(jìn)行分離提取。在前期實(shí)驗(yàn)中，嘗試通過液體深層發(fā)酵工藝培養(yǎng)菌絲體替代固體發(fā)酵制備亮菌多糖。本研究主要采用活性炭吸附色素，乙酸乙酯脫脂，sevage 法除蛋白，反復(fù)醇沉等工藝對亮菌多糖進(jìn)行提取純化。采用纖維素柱對亮菌胞內(nèi)多糖進(jìn)行了進(jìn)一步分離，并通過紅外掃描、瓊脂糖凝膠電泳、硫酸基含量測定對分離純化出的亮菌多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，以期對亮菌多糖理化性質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 材料
菌株：亮菌。
1.1.2 試劑
1.1.2.1 紙層析試劑
展開劑：正丁醇∶吡啶∶水＝6∶4∶3。
顯色劑：A：16%硝酸銀水溶液∶丙酮＝1∶9。
B：1% NaOH 乙醇溶液（W/V）。
C：6mol/L 氫氧化銨。
1.1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳
0.5%瓊脂糖溶液。
緩沖液：0.06mol/L 巴比妥緩沖液（pH＝8.6）。
染色劑：0.1%甲苯胺藍(lán)溶液。
洗脫液：醋酸∶乙醇∶水（0.1∶5∶5）。
化學(xué)試劑使用分析純。
1.1.3 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200.0g，葡萄糖 20.0g，瓊脂 18.0g，蒸餾水 1000mL，自然 pH。
液體種子培養(yǎng)基：液體 PDA 培養(yǎng)基。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 50.0g，蛋白陳 4.0g，酵母膏 1.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO40.1g，維生素 B10.03g，ZnSO40.004g，pH 6.0。
1.1.4 主要設(shè)備儀器
5804R 型離心機(jī)；RE 52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；UV-3802 準(zhǔn)雙光束紫外可見分光光度計(jì)；Spectzwm one 型傅里葉變換紅外光譜儀。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 亮菌多糖的提取
亮菌進(jìn)行液體發(fā)酵后，收集菌體進(jìn)行冷凍碾磨，8000r/min 離心 20min，將上清液濃縮至 1/10。添加1/3 體積的 75%的乙醇于上清液中，放置 12h，收集沉淀，離心后于 80℃干燥，得亮菌多糖粉末。
1.2.2 亮菌多糖的純化
純化工藝流程：亮菌多糖粉末→活性炭脫色→乙酸乙酯脫脂→savege 法除蛋白→透析去離子→沉淀干燥→纖維素柱層析法分離多糖→紙層析純度檢驗(yàn)
脫色：稱取 10g 亮菌多糖粉末，加 250mL 蒸餾水溶解，再加入 0.8g 活性碳，50℃恒溫條件下不斷攪拌，5h 后 6500r/min 離心 10min，收集上清液。脫脂：在脫色液中加入 5mL 乙酸乙酯，充分混勻后靜置 30min，待明顯分層后收集水層。
除蛋白：使用 savege 法除蛋白。將 20mL 氯仿∶正丁醇＝4∶1（V∶V）混合溶液加入脫脂后的水溶液中，充分振搖后靜置 30min，8000r/min 離心 10min，收集上清液。
去離子：將上清液裝入透析袋中，在流動(dòng)的自來水中透析 48h 后，再用蒸餾水透析 24h。
沉淀干燥：將透析后的溶液加入 1/3 體積的 75%的乙醇，靜置 12h 后離心，收集沉淀。用丙酮和乙醚溶液對沉淀進(jìn)行連續(xù)多次洗滌，將得到的亮菌多糖沉淀于 80℃干燥，碾磨后得到白色亮菌多糖粉末。
分離多糖：纖維素層析柱用纖維素填充，柱內(nèi)纖維素用乙醇預(yù)先平衡。將 0.5g 樣品加入少量無水乙醇用碾缽研成粉末，攪拌勻后緩緩加入柱中，自然沉降后，調(diào)節(jié)流速使其上下達(dá)到 1mL/min。用600mL 乙醇洗脫液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，試管收集洗脫液 5mL/每管。用改良的苯酚硫酸法測每管多糖含量，用硫酸鋇比濁法測硫酸基含量。
紙層析：用微量注射器吸取一定量樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，樣品點(diǎn)的位置距紙的一端 3cm，樣品點(diǎn)彼此間的距離為 2.5cm。樣品量 20μg，點(diǎn)樣體積在 2-20μL 之間。將點(diǎn)好樣的濾紙放入層析缸中上行層析6-8h 后，取出。在層析紙上先噴試劑 A，室溫風(fēng)干，再將紙浸入試劑 B 中，等斑點(diǎn)顯出后，再浸入試劑 C中以洗去濾紙上的 Ag2O，然后用水沖洗 1h，風(fēng)干，還原糖顯棕黑色斑點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳：離瓊脂糖板下端邊緣 1cm 處挖孔，加樣量 5μL（約 10μg 多糖）。用微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣，以葡聚糖作為對照。電壓 150V，電泳 1.5h 后，染色并脫色。
1.2.3 多糖含量的測定
采用改良的苯酚-硫酸法。
1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
將 50mL 濃硫酸緩緩加入 10mL 水中，冷卻至室溫，加入 0.6g 苯酚晶體，攪拌使其溶解配成顯色液。稱取無水葡萄糖對照品 50.0mg，定容至25mL，得到濃度為 2mg/mL 的對照品溶液。
吸取對照品溶液 1mL，2mL，4mL，6mL，8mL，10mL于 25mL 具塞比色管中，加蒸餾水 3.2mL，然后加入顯色劑 6.0mL，迅速搖勻，置沸水浴中加熱 30min后，冷水迅速冷卻至室溫。用水作參比，按分光光度法在 490nm 波長處測定吸光度。
以對照品溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A490）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖。求出回歸方程為 Y＝1.221x+0.009，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9994，說明建立的回歸方程是有意義的。
1.2.3.2 樣品中多糖含量的測定
取待測的多糖樣品液 1mL，加入顯色液 6.0mL，迅速搖勻，然后置沸水浴中加熱 30min，冷水迅速冷卻至室溫，用水做參比，按分光光度法在 490nm 波長處測定吸光度。
1.2.4 硫酸基的測定
采用硫酸鋇比濁法。
1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)確稱取 105℃干燥至恒重的的無水 K2SO4108.75mg，定容至 100mL 容量瓶中，搖勻，得到濃度為 600μg/mL 的硫酸鹽貯備溶液。
吸取 0mL，0.04mL，0.08mL，0.12mL，0.16mL，0.20mL 標(biāo)準(zhǔn)硫酸鹽溶液于具塞試管中，各管以1mol/L HCL 溶液補(bǔ)加總體積至 0.2mL，加入三氯乙酸 3.8mL 及氯化鋇－明膠溶液 1.0mL，混合勻，室溫靜置 15min，用分光光度計(jì)在 360nm 處測吸光度A1；以 1.0mL 明膠溶液代替氯化鋇溶液，同法測吸光度 A2；以硫酸基含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A1-A2）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求出回歸方程為 Y＝0.0011x+0.0015，相關(guān)系數(shù) R2＝0.9995，說明建立的回歸方程是有意義的。
1.2.4.2 樣品的測定
稱取純化后的亮菌多糖配制成 1mg/mL 多糖溶液，110℃恒溫 3h 后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得硫酸基含量。

2 結(jié)果與分析
2.1 亮菌多糖的純化
亮菌多糖顆粒經(jīng)脫色脫脂、除蛋白和透析等純化步驟后，再通過纖維素層析后收集洗脫液，用改良的苯酚硫酸法測每管含量，以管號為橫坐標(biāo)，多糖含量作為縱坐標(biāo)繪圖。分離純化后的亮菌多糖組分通過纖維素層析柱后分為三個(gè)部分，15 管之前為部分，15 到 35 管為第二部分，35 到 55 管為第三部分。、第二部分層析圖中出現(xiàn)部分雜峰，可能是由于上柱樣品中含有少量寡糖，第三部分可以明顯看出兩個(gè)峰，分析可能是由于得到的亮菌多糖含有兩個(gè)不同組分所導(dǎo)致。
2.2 紙層析結(jié)果
分別將纖維素層析柱所分離出的亮菌多糖的三個(gè)部分收集濃縮后，用微量注射器吸取一定量樣品溶液進(jìn)行紙層析。部分的點(diǎn)顏色很淡，第二部分在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的位置處出現(xiàn)了較明顯的點(diǎn)，可能是由于很少單糖和寡糖的存在，而第三部分在紙層析上沒有斑點(diǎn)，說明應(yīng)該是比較純的多糖，基本沒有單糖和寡糖的存在。通過苯酚硫酸法檢測多糖含量已達(dá)到 75%以上。
2.3 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
根據(jù)紙層析結(jié)果，第三部分多糖含量較大，且比較純。將纖維素柱層析后收集的第三部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳�？梢钥吹絻蓚€(gè)明顯的斑點(diǎn)，說明亮菌多糖存在兩個(gè)不同的組分，其結(jié)果與纖維素層析法分離結(jié)果。
2.4 亮菌多糖的結(jié)構(gòu)分析
2.4.1 亮菌多糖的紅外光譜掃描
稱取純化后的亮菌多糖 5mg 用溴化鉀壓片，置傅里葉變換紅外光譜儀 4000-400cm-1中掃描�？梢钥闯�，在 3400-3600cm-1處有強(qiáng)烈的 O-H 伸縮振動(dòng)吸收帶；2929cm-1處有強(qiáng)烈的吸收，示有-CH2或 CH3或 C-H 鍵伸縮振動(dòng)；1653cm-1和 1548cm-1處有 C=O 和 C-N 伸縮振動(dòng)吸收帶，1420-1320cm-1處有 C-O 伸縮振動(dòng)和 O-H 彎曲振動(dòng)偶合產(chǎn)生的兩個(gè)吸收帶；1040cm-1處有強(qiáng)的吸收，示有 C-O-C（糖環(huán)）的伸縮振動(dòng)；1370-1170cm-1處有強(qiáng)烈吸收，示有-O-SO2-R 和-O-SO3-的 S=O 鍵的對稱伸縮和非對稱伸縮振動(dòng)。證明純化后得到的亮菌多糖具有羥基、羰基、羥酸基、硫酸酯鍵等結(jié)構(gòu)。
2.4.2 硫酸基含量測定
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多糖的抗腫瘤、抗病毒等許多生物活性除與多糖結(jié)構(gòu)、水溶性和分子量的大小等有關(guān)外，與其含有的硫酸基團(tuán)含量(糖基所帶硫酸基的個(gè)數(shù))等也有著直接的關(guān)系。通過測定，亮菌多糖中硫酸基的含量為 98.32μg/g。紅外光譜掃描圖結(jié)果也可以證明硫酸酯鍵的存在。這為以后研究亮菌多糖的生物活性提供了理論依據(jù)。

來源：惠合膠體磨研磨設(shè)備廠

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